在此项研究中，团队聚焦高恶性肿瘤治疗预后差的临床难点，围绕“降低肿瘤负荷”与“全身免疫”相结合的治疗思路，提出将维纳刀消融技术与免疫调节相结合，利用其即时消融肿瘤和抑制转移肿瘤的协同优势的治疗新策略，开展了跨学科的协同合作和科学研究，研究了脉冲电场消融肿瘤时引起的机体免疫应答和对肿瘤微环境的调控，提出“维纳刀”联合纳米免疫药物的肿瘤治疗新策略，强效激活全身性抗肿瘤免疫反应。

重庆大学姚陈果教授团队从2000年开始，便致力于肿瘤细胞电穿孔的研究，相关成果于2004年首次发表于国际学术期刊，此后姚陈果教授团队持续研发改进产品技术，并且形成了独有的自主知识产权，是目前国际公认的电穿孔组织消融技术的先行者和引领者。在团队前期研究基础上，从脉冲参数优化的角度出发，提出了纳秒脉冲和微秒脉冲协同使用的新型脉冲形式，研制出国内外首台微纳秒协同电脉冲肿瘤消融系统—微纳刀。

原文如下：

恶性肿瘤的发病率持续上升，死亡率居高不下，治疗形势严峻，严重威胁全球人民的生命健康。我国已将治疗恶性肿瘤等重大疾病诊疗技术列为重点发展方向和亟需重点突破的优先领域。随着对分子、基因、细胞、组织和机体全方面多尺度研究的不断深入，透析复杂的肿瘤特性并提出先进有效的治疗技术迫切需要医学、生物学和工程学等多个学科的交叉与融合。其中，医工融合是解决临床应用实际需求、突破医学“卡脖子”技术的关键之钥，通过将工程技术应用于医学领域，可以开发出更先进、更精确的诊疗设备。目前，以脉冲电场不可逆电穿孔发展起来的肿瘤消融技术已成为一种新型物理治疗手段，以其独特的非热效应、微创性和选择性等突出优势，在邻近血管、重要脏器等特殊部位不可手术切除或放化疗治疗失败的高恶性肿瘤治疗展现出广阔的医学前景。

重庆大学姚陈果教授团队从2000年开始，便致力于肿瘤细胞电穿孔的研究，相关成果于2004年首次发表于国际学术期刊，此后姚陈果教授团队持续研发改进产品技术，并且形成了独有的自主知识产权，是目前国际公认的电穿孔组织消融技术的先行者和引领者。在团队前期研究基础上，从脉冲参数优化的角度出发，提出了纳秒脉冲和微秒脉冲协同使用的新型脉冲形式，研制出国内外首台微纳秒协同电脉冲肿瘤消融系统—维纳刀，通过国家药监局监督管理局III类医疗器械注册检验，成功开展首例胰腺癌和肝癌的临床试验，并在消融前列腺增生，甲状腺病变等领域有新的应用。为了突破脉冲电场肿瘤消融技术面临的临床难点以及继续拓展其临床应用，开展跨学科的协同合作和科学研究，研究脉冲电场消融肿瘤时引起的机体免疫应答和对肿瘤微环境的调控，提出“维纳刀”联合纳米免疫药物的肿瘤治疗新策略，强效激活全身性抗肿瘤免疫反应。相关工作以“Optimal Irreversible Electroporation Combined with Nano-Enabled Immunomodulatory to Boost Systemic Antitumor Immunity”为题发表在Advanced Healthcare Materials上。

在这项研究中，作者提出了一种联合治疗策略，将不可逆电穿孔技术与纳米免疫调节相结合，以增强全身性免疫反应并防止肿瘤二次生长（图1A）。首先，通过有限元分析模型、体外细胞杀伤和体内肿瘤消融实验，确定了诱导损伤相关分子模式（Damage associated molecular patterns，DAMPs）的最佳电场参数。与此同时，作者采用了FDA批准的PEG-PLGA来封装TLR7受体的小分子激动剂R837（咪喹莫特）。为了抑制或阻断PD1/PDL1通路，纳米粒子的表面进一步覆盖了一层基因工程细胞膜，该细胞膜过表达PD1蛋白。同时，脉冲电场还能重塑肿瘤微环境，促进PPR@CM-PD1纳米药物和免疫细胞的渗透。作者从原发肿瘤根除和远端肿瘤抑制两方面验证了这种综合治疗效果。上述发现凸显了新联合治疗方案在癌症免疫疗法方面的巨大潜力，并为未来的临床转化铺平了道路。

图1. “微纳刀”和PPR@CM-PD1的协同疗效示意图，以及不同脉冲电场作用下的单细胞仿真模拟。

仿真模拟研究表明（见图1），微秒脉冲和纳秒脉冲对细胞的作用位点有所不同。微秒脉冲电场（μPEF）主要引发细胞膜的电穿孔响应，而纳秒脉冲电场（nPEF）则主要影响细胞内细胞器。这种有针对性的效应可以归因于nPEF中的高频分量，其频率低于或接近细胞膜的充电时间常数。这使得细胞膜发生电渗透，从而影响细胞内的细胞器，比如细胞核。因此，微纳秒协同脉冲电场（nμPEF）不仅能够同时靶向细胞内外膜，还能增强在这两个膜上的电穿孔效应，进而对细胞产生更为强烈的影响。通过细胞杀伤实验，我们发现协同脉冲对肿瘤细胞的杀伤效果显著高于纳秒脉冲和微秒脉冲单独作用的总和。这为进一步进行活体实验提供了有力的依据，并有助于确定合适的参数设置。我们深入研究了在三种脉冲作用下细胞具有相同杀伤率的情况下，免疫原性细胞死亡的效果。与仅使用微秒脉冲相比，协同脉冲作用下，细胞膜上CRT阳性比例增加约20%，HMGB1阴性比例减少约5%，同时ATP释放量增加约一倍。这表明协同脉冲能够更充分释放肿瘤相关抗原，促使树突状细胞的成熟，从而引发更为强烈的细胞免疫反应（见图2）

图2. 脉冲电场的体外细胞杀伤效果

进一步进行活体肿瘤消融实验显示，三种脉冲均能引发细胞坏死，有效地抑制肿瘤细胞的增殖。经过协同脉冲处理后的肿瘤释放了更多的肿瘤相关抗原和DMAPs（死亡相关分子模式），从而刺激淋巴结中的树突状细胞成熟，增长了约10%。此外，协同脉冲还促进了脾脏中T细胞的增殖与分化，辅助T细胞数量增加了约6%，而毒性T细胞的数量增加了约3倍。此过程还刺激了瘤内细胞因子的释放，激活了小鼠机体的免疫应答（见图3）。应用微纳秒协同脉冲已被证明更为有效地激发机体的免疫反应。这可能是因为协同脉冲能够有针对性地作用于肿瘤细胞的多个部位，包括外膜和内部细胞器，从而最大程度地使免疫原性物质暴露在外。

图3. 脉冲电场引发的全身性免疫反应

同时，评估了脉冲电场消融原发肿瘤的效果以及对远端肿瘤的影响。三种脉冲都能立即破坏肿瘤细胞，从而安全有效地消融原发肿瘤。相较于纳秒脉冲组和微秒脉冲组中仅有2只小鼠的肿瘤完全消失，协同脉冲组对于控制原发肿瘤更有效，治愈率为50%。此外，脉冲电场还能通过促进血管通透性增加、缓解乏氧和软化致密基质来改变肿瘤微环境。遗憾的是，三种脉冲似乎都不能有效抑制远端肿瘤的生长，与对照组相比，在远端肿瘤生长方面没有观察到显著性差异（图4）。这些发现证明了脉冲电场快速有效地消除原发肿瘤的能力。然而，仅靠脉冲电场的免疫效应还不足以消灭所有残余肿瘤细胞和抑制远端肿瘤的发展。这些结果凸显了将消融疗法与免疫治疗相结合来增强全身性免疫反应的重要性。

图4. 脉冲电场的体内抗肿瘤效果

考虑到纳米材料具有作为靶向和传递多种药物的模块化平台的优越特性，研究团队开发了一种基因工程纳米囊泡，被命名为PPR@CM-PD1，用作免疫调节剂，以增强脉冲电场引发的“原位疫苗”接种反应。该纳米囊泡采用纳米沉淀法，将PEG-PLGA聚合物用于包裹R837，同时在纳米粒子外层包裹高表达PD1蛋白的细胞膜。合成的PPR@CM-PD1纳米粒子具有稳定的性能，经脉冲电场调节肿瘤基质后，这些纳米粒子能更容易渗透肿瘤组织，从而更有效地发挥其作用（见图5）。

图5. PPR@CM-PD1纳米囊泡的制备与表征

脉冲电场与免疫药物相结合，能实现“冷-热”肿瘤高效转换，提高免疫治疗疗效，有效清除肿瘤细胞且抑制复发和转移。当同时使用脉冲电场和PPR@CM-PD1进行联合治疗时，第12天原发肿瘤几乎完全消失，远端肿瘤生长显著减少了约70%，小鼠的中位生存期显著延长，从14天增加至30天（图6）。这些发现表明，脉冲电场联合PPR@CM-PD1的治疗强效消除了原发肿瘤并有效抑制了远端肿瘤的生长，是一个有前途的肿瘤治疗模式。

图6. 协同脉冲联合PPR@CM-PD1的体内抗肿瘤效果

除直接杀死肿瘤细胞外，脉冲电场可导致免疫原性细胞死亡并释放DAMPs，并导致隐藏在细胞内的肿瘤相关抗原（Tumor-associated antigen，TTA）的释放，进而激活淋巴结中的树突状细胞并使其成熟。这些成熟的树突状细胞能有效处理抗原并激活初始T细胞，从而启动T细胞介导的免疫反应。同时，协同脉冲疏松了肿瘤组织，缓解了肿瘤免疫抑制微环境，促进了免疫细胞的浸润，从而消除残留细胞，完全清除原发肿瘤。此外，纳米免疫药物更容易在肿瘤组织中积聚，免疫佐剂R837促进了树突状细胞的成熟，PD1蛋白通过PD1/PDL1检查点阻断加强了适应性免疫系统。由于T细胞被激活，脾脏产生了更多的记忆T细胞，从而有效地靶向了远端肿瘤（图7）。因此，协同脉冲改变了肿瘤微环境，导致PPR@CM-PD1在原发肿瘤内聚集增加，产生了更有效的全身性抗肿瘤免疫反应。

图7. 协同脉冲联合PPR@CM-PD1治疗的全身性免疫反应

【文章结论与讨论，启发与展望】

综上所述，作者提出一种新的肿瘤治疗策略，将消融疗法与纳米免疫调节相结合，利用了即时消融肿瘤和抑制转移肿瘤的协同优势。作者利用微纳秒协同脉冲电场（微纳刀）进行原发肿瘤消融，显示出多位点作用细胞、更高的细胞杀伤效率以及启动免疫反应等优势。同时，作者进一步开发了含有免疫佐剂咪喹莫特（R837）和PD1蛋白的基因工程化纳米粒子（PPR@CM-PD1），通过TLR7激动剂作用于先天性免疫系统和PD1/PDL1检查点阻断作用于适应性免疫系统。用协同脉冲进行局部治疗，再加上PPR@CM-PD1的全身给药，可引起有效的全身性抗肿瘤免疫反应，从而抑制原发肿瘤和远端肿瘤。鉴于脉冲电场和PPR@CM-PD1成分已获得FDA的批准或具有生物来源，我们预计这种创新方法有望实现临床转化。

重庆大学电气工程学院姚陈果教授，福建医科大学孟超肝胆医院重点实验室吴名研究员和武汉工程大学化学工程与制药学院薛亚楠为该论文的共同通讯作者，彭文成博士、曹艳兵博士研究生和张钰婷硕士研究生为本论文的共同第一作者。本研究受到国家自然科学基金（52237010和62175031）、福建省科技计划项目（2022J011282和2021J011285）、重庆市自然科学基金（cstc2020jcyj-msxmX0932）、福州市科技计划项目（2022-Y-007）、福州市卫生委员会科技项目（2022-S-rc1）和福州市“十四五”临床重点专科（20220203）等项目资助。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202302549